Novel Insights Into Intermediate Filament Assembly Through Chemical Cross-Linking

Promovendus/a: Pieter-Jan Vermeire

Promotor(en): Prof. dr. Sergei Strelkov

IF-eiwitten bij mensen die zijn gelinkt zijn aan specifieke weefsels en functies. IF-eiwitten zijn in staat tot spontane aggregatie tot typische 10-12nm brede filamenten. De primaire structuur van alle IF-eiwitten is het kenmerkende centrale 'rod'-domein van ~300 aminozuren dat een α-helische ‘coiled coil’ dimeer vormt die bestaat uit drie segmenten (coil1A, coil1B en coil2) verbonden onderling door niet α-helische, flexibele linker domeinen (L1 & L12). De ‘rod’ wordt aan beide kanten geflankeerd door α-helische terminale hoofd- en staartdomeinen. Op dit moment is het inzicht in filamentvorming laag en de moleculaire architectuur van mature IFen is slecht gekend, waardoor ons vermogen drastisch is ingeperkt om het effect van talrijke ziektegerelateerde mutaties die in veel IF-eiwitten worden waargenomen, te verklaren.
De IF-filamentvorming is gebaseerd op specifieke associaties van de elementaire bouwstenen (dimeren) in twee richtingen: de laterale (zij-aan-zij) en longitudinale (hoofd-staart). Voor cytoplasmatische IFen is de eerste aggregatietoestand een tetrameer dat oplosbaar blijft in buffers met lage ionische sterkte bij een neutrale pH. Bij toename van de ionische sterkte in vitro, associëren de tetrameren zeer snel lateraal, wat zogenaamde 'unit-length filaments' (ULF's) oplevert. ULF-vorming vindt plaats binnen één seconde en wordt gevolgd door een veel langzamere verlengingsstap door longitudinale associatie van meerdere ULFen. Vandaag de dag is echter de exacte 3D-architectuur van mature IFen nog steeds een onderwerp van hevige discussie. Er zijn verschillende mogelijkheden met betrekking tot de schikking van de tetrameren in mature IFen, evenals de symmetrie van het volledige filament.
De oplosbare vorm van cytoplasmatische IF-eiwitten is dus een tetrameer. De huidige structurele modellen van de tetrameer zijn gebaseerd op chemical cross-linking studies en gaan uit van een laterale associatie van twee rechte, niet flexibele dimeren. Hier wilden we de principes achter de vorming van de tetrameer begrijpen en zo het meest nauwkeurige atomaire model van de tetrameer verkrijgen tot nu toe, met behulp van een reeks complementaire methodes.
Eerst hebben we geprobeerd de segmenten van de 'rod'-domeinen van de K8/K18-tetrameer te kristalliseren die van de A11-vormende overlap. Alle ontworpen K8/K18-fragmenen waren gecentreerd rond coil1B en bevatten bovendien coil1A en N-terminale delen van de coil2. Alhoewel er geen kristallen werden bekomen, dienden deze fragmenten als een benchmark voor toekomstige chemical cross-linking op full-length IF-eiwitten. Zowel chemical cross-linking en small angle X-ray scattering studies voor de K8/K18-fragmenten toonden aan dat de gestrekte A11-modus niet per se de enige conformatie in oplossing is. Onze data toonden aan dat, geholpen door de flexibiliteit van L1 en L12, zowel coil1A als het N-terminale deel van coil2terug kunnen vouwen op coil1B.
In het volgende hoofdstuk laten we zien dat door het onderzoeken van een reeks progressieve truncaties, naast antiparallelle associatie van twee coil1B-dimeren (bekend als de A11-associatiemodus), de hoofd- en coil1A-domeinen in wezen betrokken zijn bij de vorming van een stabiel tetrameer. Ten tweede zorgt de nieuwe, uitgebreide lijst van cross-links voor de reconstructie van de volledige atomaire structuur van de vimentine-tetrameer. We concluderen dat de tetrameer synergetisch wordt gestabiliseerd door de interacties van de coil1B-domeinen, de interacties tussen coil1A en het N-terminale deel van coil2 en de elektrostatische aantrekking tussen de tegengesteld geladen hoofd- en staartdomeinen. Onze chemical cross-linking data geven aan dat, te beginnen met een langwerpige A11-tetrameer, de flexibiliteit van de linkers L1 en L12 het 'terugvouwen' van zowel de coil1A- als de coil2-domeinen op de tetrameer ‘core’ gevormd door de coil1B-domeinen mogelijk maakt. Door aanvullende small angle X-ray scattering studies laten we zien dat de langwerpige A11-tetrameren domineren in oplossingen met een lage ionische sterkte, terwijl er ook een aanzienlijke structurele flexibiliteit is, vooral in de terminale domeinen.
In het laatste hoofdstuk hebben we de structuur van de K8/K18-tetrameer en filamenten bestudeerd. Onze data bevestigen de waarnemingen die zijn gebeurd voor de vimentine-tetrameer: verschillende conformaties van de tetrameer bestaan naast elkaar dankzij de flexibiliteit van de linkers. Bovendien zijn er nog chemical cross-linkingexperimenten op vimentine-ULF's en vimentine- en K8/K18-mature filamenten aan de gang.
Als conclusie kunnen we zeggen dat ons werk laat zien dat de klassieke aanname voor de structurele modellen van de cytoplasmatische IF-tetrameer moet worden aangepast. Belangrijk is dat we door het combineren van chemical cross-linking en small angle X-ray scattering studies vaststellen dat er verschillende 3D-conformaties van de tetrameer in oplossing zijn. Bovendien kunnen onze chemical cross-linking data voor de volledige IF-filamentvorming en data van andere technieken samen worden geïntegreerd met elkaar om zo dichter bij het oplossen van de volledige IF-structuur te komen.