Fluorescent sensing methodologies for dynamic nanoscale events

Promovendus/a: Toon Van Thillo

Promotor(en): Prof. dr. Peter Dedecker

Het leven is dynamisch, gedefinieerd door het vermogen om homeostase te handhaven in een altijd veranderende omgeving. Op cellulair niveau vereist dit een ingewikkeld signaleringsnetwerk om activiteiten en reactiviteiten te reguleren als reactie op externe prikkels. Dit complexe netwerk kan worden onderzocht met fluorescente indicatoren, bijzondere moleculen waarvan de fluorescentie-emissie afhangt van de aanwezigheid van een specifieke stimulus, zoals een signaalmolecule. We gebruiken fluorescentiemicroscopie om deze moleculen te observeren en hun distributie door de cel te bestuderen. Deze studies suggereren dat de subcellulaire architectuur een belangrijke rol speelt in de regulatie van dit signaleringsnetwerk, zelfs tot op nanoschaal. Kwantitatieve observatie van dynamische gebeurtenissen op deze nanoschaal blijft echter een uitdaging.

In dit proefschrift beschrijven we nieuwe methodologieën die voordeel halen uit deze fluorescente indicatoren om dynamische activiteiten op nanoschaal te observeren en te manipuleren. We bespreken onze perspectief op het potentieel van en de valkuilen voor genetisch geëncodeerde biosensoren, een subklasse van fluorescente indicatoren die in levende cellen geproduceerd kunnen worden. We ontwikkelen een genetisch geëncodeerde biosensor die zeer geschikt is voor de condities die optreden bij beeldvorming op nanoschaal. Er kunnen zich echter beeldvormingsartefacten voordoen bij het observeren van deze genetisch geëncodeerde biosensoren bij hoge resolutie. Om deze artefacten te verminderen, implementeren we een correctie gebaseerd op de optische overdrachtsfunctie, een intrinsieke eigenschap van elke microscoop. Deze aanpak wordt onderzocht met behulp van computersimulaties en experimentele karakterisering. Vervolgens combineren we onze nieuwe genetisch geëncodeerde biosensor met deze analysestrategie om te laten zien hoe deze nieuwe tools gebruikt kunnen worden voor biosensing met hoge resolutie.

Echter, cellulaire signalering vindt plaats in een zeer complexe omgeving, en een kunstmatig systeem dat deze complexiteit vermindert zou de experimentele karakterisering kunnen vereenvoudigen. Daarom implementeren we ook een modelsysteem dat signaleringsgebeurtenissen op nanoschaal kan nabootsen. We gebruiken bacteriële eiwitten die nanokanalen vormen in lipidemembranen om snel zulke kunstmatige nanodomeinen te creëren. Deze zogenaamde biologische nanoporiën laten kleine moleculen en ionen door en deze passage kan gemanipuleerd worden door een extern elektrisch veld aan te brengen. We argumenteren dat we deze elektrische manipulatie kunnen gebruiken om kortlevende nanodomeinen te creëren in de buurt van de opening van de nanoporie. We selecteren calcium om ons modelsysteem te karakteriseren en observeren de vorming van nanodomeinen met een fluorescente calciumindicator. We bevestigen dat het nanodomeinvolume nauwkeurig kan worden gecontroleerd en leveren bewijs voor submilliseconde manipulatie van de nanoporie, waardoor het kleinste snel controleerbare reactievolume tot nu toe wordt gegenereerd.