Unravelling the biosynthesis and mode of action of specialized metabolites

Promovendus/a: Thomas Lathouwers

Promotor(en): Prof. dr. ir. Rob Lavigne; Prof. dr. ir. Christiaan Michiels; Mevrouw Joleen Masschelein

De toenemende verspreiding van resistente pathogenen vormt één van de grootste uitdagingen voor de mensheid in deze eeuw. De hoge nood aan nieuwe antibiotica vormt de drijfveer voor de hernieuwde interesse in natuurlijke middelen zoals bacteriële secundaire metabolieten. Secundaire of gespecialiseerde metabolieten zijn opgebouwd uit complexe, chemische structuren en kunnen een brede waaier aan functies vervullen, gaande van immunosuppressiva, antitumorale geneesmiddelen, onkruidverdelgers tot antibacteriële middelen. Ongeveer 15 jaar geleden bracht doorgedreven sequentieanalyse van bacteriële genomen onverwacht nieuwe metabolietgenclusters aan het licht. Karakterisatie van deze clusters met aandacht voor hun toekomstig potentieel werd al snel een groeiende onderzoekstak. De laatste jaren is de focus verder verschoven naar de chemische optimalisatie van deze moleculen om ze bijvoorbeeld thermisch stabieler te maken.

In het eerste gedeelte van dit doctoraatsonderzoek werden eiwit-eiwitinteracties opgespoord tussen de verschillende enzymatische domeinen van biosynthetische assemblagelijnen. Het in kaart brengen van deze interacties kan helpen om de assemblage later te manipuleren richting een hogere opbrengst of om een nieuwe structuur te creëren. Deze analyse werd uitgevoerd op de hybride assemblagelijnen van zowel de zeamine- als kalimantacine-antibiotica, twee secundaire metabolieten gekarakteriseerd op het Laboratorium voor Gentechnologie. In het tweede gedeelte van dit doctoraatsonderzoek verschoof de focus naar de identificatie van het moleculaire doelwit van kalimantacine. Kennis omtrent de specifieke interactie tussen kalimantacine en zijn doelwit maakt het mogelijk om de antibacteriële component chemisch te wijzigen om zo eventuele resistentie tegen kalimantacine te omzeilen.

De zeamines worden geproduceerd door een combinatie van vetzuursynthasen, polyketidesynthasen en niet-ribosomaal peptidesynthetasen in Serratia plymuthica RVH1. Om hierin eiwit-eiwitinteracties op te sporen werd de assemblagelijn verdeeld in de verschillende enzymatische domeinen en linkerregio’s, wat een totaal van 48 testfragmenten opleverde. Deze eiwitten werden via een grootschalige yeast two-hybrid (Y2H)-screening getest op eiwit-eiwitinteracties. Drie potentiële interacties werden ontdekt gedurende deze test, waarvan er één werd bevestigd via hertesting, namelijk de dimeervorming tussen ketoreductase domeinen. In een poging om meer interacties op te sporen werd het eerste deel van de zeamine pathway opnieuw getest via bacterial two-hybrid (B2H)-analyse. Dit leverde enkele nieuwe interacties op, o.a. de dimeervorming van de ketosynthase en thioreductase domeinen.

Kalimantacine wordt geproduceerd door een hybride PKS-NRPS assemblagelijn in Pseudomonas fluorescens BCCM_ID9359. De eiwitinteractiekaart van kalimantacine was reeds in 2016 opgesteld en toonde 28 potentiële interacties, waarvan er 13 konden bevestigd worden via Y2H-hertesten en vijf via de daaropvolgende B2H-analyse. Deze screens toonden het bestaan aan van eiwitinteracties tussen in trans modificerende enzymen en de centrale productieketen, dimeervorming tussen domeinen binnen een module en eiwitinteracties tussen opeenvolgende modules. Vervolgens werden enkele alternatieve methoden uitgeprobeerd om het aantal ontdekte interacties op te krikken. Zo werd bijvoorbeeld een Sfp-proteïne toegevoegd aan de Y2H-screen om de transportdomeinen structureel te activeren in de hoop om zo meer interacties te detecteren, maar zonder resultaat. Daarnaast werd een nieuwe in vivo ‘pull-down’-methode ontworpen en uitgeprobeerd op de in trans modificerende enzymen van de kalimantacine assemblagelijn. Hierbij werd een mogelijke interactie geïdentificeerd tussen twee enzymen die deel uitmaken van de methylincorporatiecassette.

In het tweede deel van dit doctoraatsonderzoek werd via co-kristallisatie en in vitro enzymatische testen aangetoond dat kalimantacine wel degelijk FabI, een essentieel enzym van de bacteriële vetzuursynthese, inhibeert. Kalimantacine gaat namelijk in competitie met het enoyl-substraat voor plaats in de actieve site van het enzym. Initieel resistentie-onderzoek vond verschillende puntmutaties in de coderende genoom- en promotorregio van fabI, die zouden kunnen zorgen voor een verhoogde resistentie van FabI tegen kalimatancine. FabI enzymen die afzonderlijk eiwitmutaties Y147C, M99T, Q57R, D177G, Y147C-M99T en Y147C-D177G hadden, vertoonden allemaal een verhoogde resistentie tegen kalimantacine. Wanneer deze mutante enzymen heteroloog tot expressie werden gebracht in Staphylococcus aureus RN4220 verhoogden ze de minimaal inhibitorische concentratie van de bacterie tegen kalimancine minstens viervoudig ten opzichte expressie van het origineel FabI enzym in S. aureus. Twee mutaties in de promotorregio van het fabI gen, T109G en A72G, zorgden voor een toename van fabI expressie, wat leidde tot een verhoogde tolerantie voor kalimantacine. Het bestrijden van deze FabI mutante enzymen vormt zeker een uitdaging, aangezien de stammen met één van de drie mutante FabI enzymen, (Y147C), (Y147C-M99T) of (Y147C-D177G), ook resistentie vertoonden tegen de gekende inhibitor triclosan. Finaal werd ook nog FabI isozym BatG gekarakteriseerd. Dit enzym is deel van de kalimantacine productiepathway en werkt gelijkaardig als FabI, maar is compleet ongevoelig voor kalimantacine. De aanwezigheid van BatG verklaart dus de intrinsieke resistentie van de producerende stam Pseudomonas fluorescens BCCM_ID9359 tegen zijn eigen component.

Deze bijkomende inzichten in de werkingsmechanismen en doelwit van secundaire metabolieten leveren fundamentele kennis om de componenten in een later stadium succesvol te manipuleren. De bijkomende resistentieanalyse tegen kalimantacine geeft al een eerste idee waar de mogelijke problemen omtrent kalimantacineresistente stammen zich zouden kunnen situeren, zodat voorzorgsmaatregelen tijdig genomen kunnen worden.