Exploring interspecific yeast breeding for industrial application

Promovendus/a: Stijn Mertens

Promotor(en): Prof. dr. ir. Kevin Verstrepen

Bier is de gefermenteerde drank bij uitstek en is op wereldgebied, met een jaarlijkse productie van meer dan 1.96 miljard hectoliter, de derde meest geconsumeerde drank (na water en thee). Traditioneel bestaan er twee soorten bier; namelijk bieren van hoge (‘ale’)- en lage (‘lager’) gisting (meestal pils-type bieren).

Pilsbieren, dewelke instaan voor 90% van de totale wereldwijde bierproductie, worden exclusief gebrouwen met de pilsbiergist Saccharomyces pastorianus. S. pastorianus is geen pure gistsoort, maar is het resultaat van een interspecifieke kruising tussen enerzijds de alom bekende brouwers en bakkers gist S. cerevisiae en anderzijds een koude tolerante en wilde gist S. eubayanus. De gelimiteerde genetische diversiteit binnen pilsbiergisten reflecteert zich in de gelimiteerde invloed van deze gisten op de smaak en aroma van pilsbieren, zeker wanneer men dit vergelijkt met de overweldigende diversiteit aan bovengistingsbieren.

Desondanks het feit dat het succes van pilsbieren grotendeels te danken is aan de typerende frisse smaak en hoge drinkbaarheid, wordt differentiatie en diversiteit steeds belangrijker, dit om tegemoet te komen aan de dalende consumptie van pilsbieren, en de verandering van een meer globale biermarkt, naar een niche-gedreven markt. De ontwikkeling van nieuwe pilsbiergisten kan helpen om een nieuw type bier te ontwikkelen, dat de verbinding maakt tussen enerzijds de diverse en aromatische bovengistingsbieren en anderzijds de frisse en vlot drinkende pilsbieren.

Hiertoe werd er een ‘spore-to-spore’ kruisingstechniek toegepast om zes specifiek geselecteerde S. cerevisiae gisten te kruisen met twee verschillende S. eubayanus gisten. Een representatieve set van 31 nieuwe interspecifieke hybride-gisten werd vervolgens getest voor hun temperatuurtolerantie, alsook hun fermentatiecapaciteit en aromaproductie in laboschaal en (voor sommigen) pilootschaal pilsbierfermentaties. Algemeen vertoonden de ontwikkelde interspecifieke gisthybriden een significant betere groei bij lage temperaturen (4°C tot 16°C) in vergelijking met hun respectievelijke S. cerevisiae ouderstammen, alsook een significant betere groei bij hoge temperaturen (30°C tot 37°C) in vergelijking met hun respectievelijke S. eubayanus ouders. Ten eerste, zorgde de verbrede temperatuurtolerantie van de nieuwe gisthybriden voor een competitief voordeel in fermentaties bij koudere temperaturen ten opzichte van hun S. cerevisiae ouderstammen. Daarenboven, onderstrepen deze resultaten de capaciteit van interspecifieke hybriden om eigenschappen van de twee verschillende oudersoorten te combineren in één nieuw gegenereerd micro-organisme. Naast de verbrede temperatuurtolerantie, vertoonden de meeste nieuw gegenereerde interspecifieke gisthybriden een beterde fermentatiecapaciteit in vergelijking met beide ouderstammen in labo- en piloot-schaal pilsbierfermentaties, uitgevoerd bij respectievelijk 16°C en 12°C. Sommige nieuwe interspecifieke gisten produceerden zelfs gelijkaardige ethanolconcentraties dan de huidige commercieel toegepaste pilsbiergisten. De aromaproductie van de gegenereerde interspecifieke gisthybriden verschilde tevens significant van de aromaproductie van de huidige, commercieel toegepaste pilsbiergisten, wat het potentieel van deze nieuwe hybridegisten onderlijnt voor de productie van nieuwe biertypes, die het vacuüm tussen de goed drinkbare, frisse pilsbieren en aromarijke en diverse bovengistingsbieren opvullen.

Naast gewenste fenotypische eigenschappen, erfden gegenereerde interspecifieke gisthybriden doorgaans ook enkele ongewenste eigenschappen van de ouderstammen. Het grotendeel van de nieuwe gisten waren bijvoorbeeld instaat om ferulazuur om te vormen naar 4-vinyl guaiacol, het welke een doorgaans ongewenste kruidnagel-achtige geur en smaak aan bier toevoegt. Om de productie van fenolische ‘off-flavours’ (POF) door de nieuw gegenereerde interspecifieke gisthybriden te onderzoeken, werd er een nieuwe ‘high-throughput’ absorptie-gebaseerde methode ontwikkeld die toelaat om zeer snel het POF-fenotype van honderden gisten in parallel te beoordelen, en dit met een minimum aan werk, ingrediënten of dure apparaten. De ontwikkelde nieuwe metode verhoogde niet enkel het aantal gisten dat in parallel getest kan worden, maar reduceerde ook het bijhorende kostenplaatje significant, alsook vertoonde het een betere accuraatheid in vergelijking met de bestaande ‘State of art’ methodes.

De nieuwe ontwikkelde test werd vervolgens gebruikt, wanneer een ‘CRISPR-Cas9-based gene editing’ strategie geoptimaliseerd en toegepast werd om POF- cisgenetische varianten te creëren van nieuw ontwikkelde en genetisch complexe interspecifieke gisthybriden. Meer precies, werd er een natuurlijk-voorkomende ‘single nucleotide polymorphism’ (SNP) in het ferulazuur decarboxylase-coderend FDC1-gen, het welke gedeeld wordt door de meerderheid van de huidige POF- bovengistingsbiergisten, geselecteerd en geïntroduceerd in het S. eubayanus verkregen FDC1-allel van het interspecifieke hybride genoom met behulp van de geoptimaliseerde ‘CRISPR-cas9-based gene editing’ methode. Vooreerst was dit mogelijk zonder de introductie van voorheen gerapporteerde ‘Loss of Heterozygosity’ of andere vormen van ‘off-target’-activiteit. Daarnaast werden er in uitgevoerde laboschaalfermentatie-testen geen fenotypische bijwerkingen gedetecteerd, wat leidde tot de ontwikkeling van aromatisch diverse maar POF- nieuwe pilsbiergisten.