Structural and biochemical characterization of ryanodine receptors in lipid environment

Promovendus/a: Katrien WILLEGEMS

Promotor(en): Prof. dr. Rouslan Efremov

Ryanodine receptoren (RyR) zijn ionkanalen die zich in sarcoplasmatische of endoplasmatische reticulummembranen bevinden. Ze koppelen actiepotentialen aan spiersamentrekking via een proces dat bekent staat als excitatie-contractie koppeling en dit door het vrijkomen van calcium uit de intracellulaire calciumopslag. De rol van RyR is voornamelijk bestudeerd in spiersamentrekking, maar deze receptoren komen ook tot expressie in vele andere celtypes, inclusief zenuw-, gladde spier-, endotheel- en alvleeskliercellen. In deze cellen is de exacte rol van RyR in calcium homeostase veel minder beschreven. Meer dan 800 mutaties in RyR zijn gelinkt met ziekten in de mens, wat van RyRs belangrijke doelwitten maakt voor geneesmiddelen. Moderne en rationele geneesmiddelenontwikkeling is gebaseerd op structuren met een hoge resolutie van deze doelwitten in complex met regulatoren. Met de recente vooruitgang in cryo-EM, is de structuurbepaling van membraaneiwitten in een stroomversnelling geraakt. Membraaneiwitten zijn geëvolueerd om ingebed te zijn en te functioneren in een dubbele fosfolipidenlaag en het belang van deze nauw intragerende lipiden voor de eiwitstructuur, -functie en -stabiliteit is reeds aangetoond voor verschillende belangrijke ionkanalen.
Het doel van dit PhD project was de bepaling van de hoge resolutie structuur van RyR2, de hartvariant, met cryo-EM. In dit PhD werk, werd eerst een nieuwe zuiveringsstrategie voor RyR1 ontwikkeld, het ionkanaal gereconstitueerd in lipide nanodiscs en werd een biochemische en structurele karakterisering van RyR1 in een lipide omgeving uitgevoerd. De structuur van RyR1 in nanodiscs werd bepaald onder twee condities die de open conformatie van het kanaal in een lipide omgeving ontsluierden. Vergelijking met gepubliceerde RyR1 structuren in detergenten en bijkomende functionele karakterisering legde het effect van lipide mimetica op de open-probabiliteit van het kanaal bloot. Daarnaast werd gezuiverd RyR1 gebruikt voor de aanmaak van RyR-specifieke nanobodies dat gebruikt werden om een nieuwe nanobody-gebaseerde zuivering van RyR2 uit runderhart te ontwikkelen. De nieuwe, snelle, reproduceerbare en kleinschalige zuivering heeft geleid tot de optimalisatie van de staalvoorbereiding voor cryo-EM. Intermediaire resolutie structuren van RyR2 werden bepaald met gebruik van cryo-EM. Deze resultaten maken de weg vrij voor de structurele karakterisering van RyR2 in complex met modulators richting de ontwikkeling van efficiënte geneesmiddelen voor de hartritmestoornissen CPVT1 en ARVD2, die een belangrijke oorzaak zijn van acute hartdood bij jonge mensen.