Wenst u een activiteit te laten opnemen in deze lijst? Geef uw activiteit door via dit formulier.

 

Development and evaluation of HDAC and Hsp90 PET ligands

ic-school-black-48dp-14
Categorie
Doctoraatsverdediging
Datum
2019-07-01 17:00
Locatie
KU Leuven, Aula van de Tweede Hoofdwet, 1.02 - Kasteelpark Arenberg 41
3001 Heverlee, Belgie

Promovendus/a: Koen Vermeulen

Promotor(en): Prof. dr. Guy Bormans

Positron emissie tomografie (PET) is een translationele, hoog sensitieve in vivo moleculaire beeldvormingstechniek die de dynamische lichaamsverdeling van positron emitter speurstoffen in kaart te brengen. Specifieke hoge-affiniteit interactie van de PET-speurstof laat toe de expressie van hun biologische doelwitmoleculen te kwantificeren. Andere beeldvormingsmodaliteiten zoals kernspin tomografie of Röntgen beeldvorming geeft veelal een hoge resolutie anatomische weergave van het lichaam met beperkte informatie over moleculaire processen.

PET speurstoffen kunnen radioactief gemerkt worden met positron emitter isotopen van biologisch relevante elementen zoals C, N, O en F die vaak voorkomen in biomoleculen of geneesmiddelen die hoge affiniteitsinteracties hebben met ziekte-relevante biomerkers. Het is dan theoretisch mogelijk om deze moleculen radioactief te merken zonder de biomerker affiniteit te compromitteren. De resulterende radioactieve speurstof wordt bij een PET onderzoek toegediend in uiterst kleine massa hoeveelheden waardoor farmacologische of toxicologische (neven)werkingen worden vermeden.

In vivo beeldvorming van ziekte-relevante biomerkers met PET laat toe om patiënten te selecteren die waarschijnlijk zullen beantwoorden aan een specifieke therapie en ook de respons van de therapie te monitoren in lijn met de “gepersonaliseerde geneeskunde” benadering.

Afwijkingen van de cellulaire homeostase die gereflecteerd worden in een gewijzigde expressie van de biomerker kunnen met PET in een vroegtijdig stadium gedetecteerd worden, voorafgaand aan morfologische wijzigingen. Verder kan PET toegepast worden in geneesmiddel ontwikkeling voor de in vivo bepaling van farmacodynamische parameters, het aantonen van binding aan het doelwit en het bepalen van de dosis-bezettingsgraad relatie van het kandidaat geneesmiddel.

Epigenetica beschrijft de studie van wijzigingen in gen expressie die niet gerelateerd zijn aan de DNA sequentie van het gen. Dit wordt gemedieerd door post-translationele modificaties (PTMs) op histonen, die leiden tot structurele wijzigingen van chromatine met verandering van DNA transcriptie tot gevolg. Eén van de meest bestudeerde PTMs is de acetylatie van lysine residu’s op de zogenaamde histon staarten. De acetylatie en de-acetylaltie wordt gemedieerd door respectievelijk histon acetyltransferase (HAT) en histon deacetylase (HDAC). Geacetyleerd-lysine, leidt tot een veelal open chromatine structuur, waarop DNA transcriptie kan plaatsvinden. Gede-acetyleerd lysine daarentegen laat interacties toe tussen de positief geladen basische aminozuren (lysine, arginine) en het negatief geladen DNA. Dit gaat gepaard met de condensatie van de chromatine streng waardoor DNA transcriptie wordt bemoeilijkt. Deze wisselwerking tussen acetylatie en de-acetylatie beïnvloedt de geacetyleerde chromatine homeostase die een effect heeft op de algemene celhomeostase. Epigenetische modificaties zijn dus belangrijke regulatoren van de gen expressie en gen expressie variabiliteit. Niet enkel histonen zijn substraten van HDAC, aangezien cytosolaire eiwitten (heat shock proteins (Hsp), cortactin en α-tubuline) alsook verschillende transcriptiefactoren acetyl bindingsdomeinen bezitten. Tot nu toe zijn 18 HDACs beschreven in de literatuur, met specifieke maar ook overlappende moleculaire functies. Algemeen is de rol van HDACs in kanker goed gedocumenteerd maar HDACs spelen ook een rol in onder andere neurodegeneratie en hart- en vaat aandoeningen.

Het moleculaire chaperon, Hsp90, vooral terug te vinden in het cytosol van cellen, is afhankelijk van ATP voor het vouwen, matureren en verwijderen van meer dan 400 proteinen. Hsp90 maakt tot 2% uit van de totale cellulaire eiwit populatie. Deze fractie kan stijgen tot 7-10% in kankercellen door blootstelling aan cellulaire stress. Veel van de “cliënt”-eiwitten die gevouwen worden door Hsp90 zijn betrokken in moleculaire processen die kanker veroorzaken. In een tumorcel bevindt Hsp90 zich in een stress toestand waardoor Hsp90 een functioneel netwerk vormt met andere chaperones waardoor de affiniteit voor Hsp90 inhibitoren met een factor 100 toeneemt. In tumorcellen en bij wondheling wordt Hsp90 ook actief getransporteerd naar de celmembraan en de extracelullaire matrix (ECM). Hoge expressie van extracelullair Hsp90 (eHsp90) werd waargenomen bij verschillende kankers (fibrosarcoom, melanoma, borst kankers) en dit wordt in verband gebracht met het metastaseringsproces.

Meer dan 15 Hsp90 inhibitoren werden reeds geëvalueerd in klinische studies. De rol van Hsp90 in kanker is goed gedocumenteerd en recente publicaties suggereren ook een rol van Hsp90 bij neurodegeneratieve aandoeningen.

In onze zoektocht naar een selectieve HDAC2 PET speurstof werden verschillende moleculen uit de literatuur, gebaseerd op Santacruzamate A, in vitro en in silico geëvalueerd. Deze moleculen werden beschreven als potente en selectieve HDAC2 inhibitoren. De resultaten van de in silico studies, lagen in lijn met resultaten verkregen met in vitro affiniteits bepalingen. Maar markante discrepanties werden opgemerkt ten opzichte van de eerder gerapporteerde affiniteitswaarden. Moleculaire docking studies werden uitgevoerd om een beter beeld te krijgen van de belangrijkste moleculaire interacties van de gesynthetiseerde verbindingen met het HDAC2 enzyme. In controle docking-studies met referentiemoleculen (Martinostat, SAHA, TSA) werden belangrijke π-π interacties opgemerkt, die niet aanwezig waren bij Santacruzamate A en derivaten. De affiniteit van de verschillende moleculen voor HDAC2 werd bepaald in 2 onafhankelijke laboratoria aan de hand van twee verschillende bepalingsmethoden. Hieruit bleek dat de gerapporteerde waarden niet gereproduceerd konden worden en dat deze moleculen geen affiniteit voor HDAC2 vertoonden. Santacruzamate A en derivaten zijn dus niet geschikt als HDAC2 inhibitoren en worden ook niet verder ontwikkeld als HDAC2 PET speurstof.

Verder hebben we [11C]KB631, een selectieve en potente HDAC6 speurstof, gebruikt om HDAC6 expressie in melanoma tumoren op te sporen. Deze speurstof werd gevalideerd in in vitro autoradiografie studies op hersen en tumor coupes en in ex vivo biodistributie studies in muizen. B16.10 melanoma geïnoculeerde en gezonde muizen werden voorbehandeld met KB631, de HDAC6-selectieve inhibitor Ricolinostat of de pan-HDAC Inhibitor SAHA, om de binding specificiteit te bepalen in gezond en tumorweefsel. Verder werd ook een µPET studie uitgevoerd, waar de weefselverdeling van de speurstof in controle condities werd vergeleken na voorbehandeling van muizen met Ricolinostat, om zo in vivo de bindingsspecificiteit te evalueren. In in vitro studies bleek de speurstof specifiek te binden aan hersenweefsel, PC3 prostaat carcinoma en B16.F10 melanoma secties. In tumorweefsel werd een eerder heterogeen bindingspatroon vastgesteld. In de ex vivo biodistributie experimenten werd slechts beperkte hersen opname van [11C]KB631 geobserveerd. Algemeen werd een relatief lage opname van de speurstof in de tumor opgemerkt, maar deze opname was wel HDAC6 specifiek. Verder onderzoek is nodig om het potentieel van [11C]KB631 als HDAC6 tumor speurstof uit te klaren.

NMS-E973 werd gerapporteerd door Brasca et al. als een potente en selectieve Hsp90 inhibitor met cytotoxische eigenschappen in verscheidene types tumorcellen. We hebben [11C]NMS-E973 ontwikkeld en gevalideerd als een PET speurstof, voor visualisatie van Hsp90 in melanoma. De bindingspecificiteit van [11C]NMS-E973 aan B16.F10 melanoma cellen werd onderzocht door voorbehandeling met PU-H71, een niet-structureel verwante Hsp90 inhibitor. In in vitro en ex vivo autoradiografie experimenten werd binding van [11C]NMS-E973 getest op verschillende tumor coupes (B16.F10 melanoma, PC3 en LNCaP prostaat carcinoma, SKOV-3 ovarium carcinoma) en spierweefsel.

Duidelijke verschillen werden opgemerkt tussen in vitro en in vivo binding van dezelfde spierweefselcoupes, waarbij binding van de speurstof in vivo opmerkelijk lager was dan in vitro. Wat duidt op een wijzigende expressie en/of activiteit van Hsp90 in stervend/hypoxisch en dood weefsel. [11C]NMS-E973 werd extensief gevalideerd in een µPET experiment, waar de speurstof opname in B16.F10 melanoma geïnoculeerde muizen in controle condities vergeleken werd met voorbehandeling met 2 niet-structurele verwante Hsp90 inhibitoren (PU-H71 en Ganetespib). [11C]NMS-E973 binding in de tumor kon bijna volledig geïnhibeerd worden door voorbehandeling met beide verbindingen waardoor de specificiteit van [11C]NMS-E973 bewezen werd. Verder werden de resultaten verkregen in de µPET studies bevestigd in ex vivo biodistributie studies. Hier werd een duidelijke toename van Hsp90 in het bloed en sterk doorbloed weefsel (longen en milt) waargenomen in tumormuizen in vergelijking met gezonde muizen. Dit suggereert op afscheiding van Hsp90 vanuit de tumor naar het bloed en verspreiding hiervan naar de rest van het lichaam, maar deze hypothese dient verder onderzocht te worden.

Eerdere publicaties stelden dat NMS-E973 door de bloed-hersen barrière (BHB) kon permeëren maar dit werd niet waargenomen in onze studies met [11C]NMS-E973. Daarom zijn we op zoek gegaan naar Hsp90 inhibitoren met fysicochemische parameters die hersenopname wel toelaten. In samenwerking met Novartis, hebben we [11C]YC-72-AB85 geïdentificeerd als potentieel molecule dat hieraan voldoet. In een gelijkaardige ex vivo biodistributie studie op B16.F10 melanoma muizen zoals uitgevoerd met [11C]NMS-E973, werd waargenomen dat [11C]YC-72-AB85 ook specifiek bindt aan tumor weefsel. Verder werd er ook in vitro specifieke binding van [11C]YC-72-AB85 waargenomen, op hersen coupes van rat en muis alsook in vivo in een µPET studie bij ratten. Voorbehandeling van de ratten met Onalespib induceerde een verhoogde hersenopname van de speurstof in de hersenen, gemedieerd door verzadiging van perifeer Hsp90. Deze verhoogde hersenopname kon significant verlaagd worden door injectie van YC-72-AB85 of SNX-0723, 20 min na start van de µPET scan. Hieruit kon ook geconcludeerd worden dat Onalespib slechts in beperkte mate de BHB permeërt.

In conclusie, in de zoektocht naar een selectieve HDAC2 PET tracer, gebaseerd op Santacruzamate A en derivaten werden markante verschillen opgemerkt tussen onze in silico en in vitro studies en de gerapporteerde literatuur met betrekking tot activiteit/affiniteit voor HDAC2. Hieruit werd besloten dat Santacruzamate A en derivaten daarvan, niet verder gebruikt kunnen worden als HDAC2 PET tracers. Verder werden PET tracers voor visualisatie van HDAC6 en Hsp90 in oncologische conditities ontwikkeld en geëvalueerd. [11C]YC-72-AB85, kon verder ook gebruikt worden om Hsp90 in het centrale zenuwstelsel te visualiseren. Al de onderzochte tracers werden in vitro geëvalueerd met autoradiografie studies op tumour en/of brein coupes van knaagdieren. In deze experimenten bleken de tracers specifiek te binden. Specifieke binding van de tracers werd ook vastgesteld in in vivo experimenten in een B16.F10 melanoma muis model, onderzocht door voorbehandelingstudies met structureel onverwante HDAC6 of Hsp90 inhibitoren. In het bloed van tumourmuizen konden verhoogde Hsp90 niveaus opgemerkt worden met beide Hsp90 PET tracers. Deze opregulatie van Hsp90 werd echter niet opgemerkt in het bloed van gezonde muizen. De uitgevoerde preklinische resultaten geven aan dat de geëvalueerde PET tracers potentieel gebruikt kunnen worden om de expressie van HDAC6 of Hsp90 te quantificeren in vivo in kanker of hersenen. Verder zouden deze tracer gebruikt kunnen worden om een dosis-effect relatie op te stellen in therapieën met HDAC6 of Hsp90 geneesmiddelen in een klinische setting.
 
 

Alle datums

  • 2019-07-01 17:00

Powered by iCagenda

Meer activiteiten

Bezoek de website van volgende organisaties om hun activiteiten te bekijken:

C2W | Mens & Molecule