Vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie voor de routinemeting van steroïdhormonen in humaan serum

Promovendus/a: Steven Pauwels

Promotor(en): Prof. dr. Pieter Vermeersch Prof. dr. Dirk Vanderschueren

Steroïdhormonen zijn fysiologisch belangrijke moleculen die gemeten worden in humaan serum bij diagnose of opvolging van diverse aandoeningen. Ze spelen een rol in Routinematig worden deze hormonen vaak gemeten op volledig geautomatiseerde platformen in klinische laboratoria. Het reactieprincipe van deze methodes is bijna steeds immunologisch. Ondanks hun gebruiksvriendelijkheid zijn er enkele fundamentele problemen verbonden aan deze technieken. De best gekende problemen zijn kruisreactiviteit met (structureel) gelijkende molecules, interferentie van auto- of anti-reagensantilichamen, matige performantie bij zeer laag geconcentreerde analieten en verschillen tussen fabrikanten. Kruisreactiviteit is zeer relevant voor steroïdhomoonmetingen, gezien humaan serum meerdere gelijkende steroïdhormonen, metabolieten en (eventueel) medicatie bevat. Verder is de concentratie van enkele belangrijke steroïdhormonen zeer laag (picomolair) in relevante patiëntengroepen (17β-estradiol bij kinderen, postmenopausale vrouwen en postmenopausale borstkankerpatiënten onder aromatase inhibitoren; 1α,25-dihydroxyvitamine D (vitamin D hormoon) en testosteron bij vrouwen en kinderen). Tenslotte circuleren de lipofiele steroïdhormonen bijna volledig gebonden aan eiwitten in waterig humaan serum. Een volledige vrijzetting van de respectievelijke bindingseiwitten is noodzakelijk om de totale concentratie adequaat te kunnen meten. Deze stap is vaak niet helemaal effectief bij geautomatiseerde immunologische methodes.

Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) gebaseerde methodes zijn in staat hogervermelde tekortkomingen grotendeels op te vangen. Het routinematig aanbieden van deze methodes wordt echter bemoeilijkt door de investeringkost, de nood aan expertise, beperkte service van de fabrikanten, en de vele manuele stappen. Het blijft ook een uitdaging om LC-MS/MS methodes met eenvoudige staalvoorbereiding te ontwikkelen voor de laag geconcentreerde steroïdhormonen.

We ontwikkelden en valideerden LC-MS/MS methodes met minimale staalvoorbereiding voor de hogervermelde laag geconcentreerde steroïdhormonen. Hiervoor combineerden we gepubliceerde technische concepten (2-dimensionale chromatografie, adduct-vorming, buffer-additieven) en onderzochten nieuwe concepten (signaal sommatie) om de gevoeligheid op te drijven. De moeilijk- en mogelijkheden verbonden aan deze aanpak worden geïllustreerd door de ontdekking van een nieuwe metaboliet van vitamine D welke een isobaar en stereo-isomeer is van 1α,25-dihydroxyvitamine D, 1βα,25-dihydroxyvitamine D, welke potentieel klinisch relevant is. De klinische bruikbaarheid van de ontwikkelde methodes werd aangetoond in relevante patiëntgroepen.

We onderzochten ook de haalbaarheid en kosten-effectiviteit van LC-MS/MS voor routine analyses, uitgevoerd door niet-experten met acceptabele performantie en rapporteertijd. Hiervoor ontwikkelden en valideerden we LC-MS/MS methodes voor de meting van 25-hydroxyvitamine D in serum (18 000 stalen/jaar) en immunosuppressiva dosage in volbloed (35 000 stalen/jaar met relatief snelle rapporteertijd in transplantatiecentra). We automatiseerden de staalvoorbereiding (eiwitprecipitatie) op een pipetteerrobot, uitgerust met naalden om zowel volbloed als serum te pipetteren. We pasten interface en data-overdracht aan voor gebruik door laboranten met weinig ervaring. Het ontwikkeld proces laat niet-experten toe om kosten-effectief LC-MS/MS methodes te lopen, ook buiten reguliere werkuren, met acceptabele rapporteertijd (<4u). Eenvoudige staalvoorbereiding door eiwitprecipitatie was belangrijk om een kosten-effectieve overgang van immunologische technieken te realiseren, alsook de automatisatie te faciliteren. De robuustheid van deze systemen blijft echter suboptimaal (vooral pipetteerrobot) en het voorzien van backup procedures is aangewezen. Verficatie is aangewezen indien manuele staalvoorbereiding als backup voor een pipetteerrobot wordt gebruikt, gezien er toch kleine